CRISPR-Cas9の輸送にCRISPR-Goldを用い､マウス･モデルでデュシェンヌ型筋ジストロフィー突然変異を治療
University of California, Berkeleyの研究グループは､CRISPR-Cas9遺伝子編集技術を細胞内に送り込む方法を新しく考案し､マウス･モデルを使って､筋肉衰弱の疾患であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーを引き起こす突然変異を修復できることを確かめた｡この新研究では､デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスにCRISPR-Goldと名付けられたCRISPR-Cas9輸送系を1回注射するだけで､対照グループに比べて突然変異遺伝子修復率18倍､筋力と敏捷性テストで2倍の成績を達成した｡
この研究の共著者で､UC BerkeleyのMolecular and Cell BiologyとChemistryの教授を兼任するDr. Jennifer DoudnaとMax Planck Institute for Infection Biology所属のEmmanuelle Charpentierが､2012年にCas9タンパク質を転用して､安価､正確かつ使いやすい遺伝子編集技術を開発して以来､研究者は､CRISPR-Cas9を基礎とした治療法が遺伝病の治療に革命をもたらすのではないかと期待している｡しかし､遺伝病治療法の開発は､医学界でも依然として難問のままである｡それというのも､遺伝病のほとんどは､疾患の原因となる遺伝子の突然変異を正常なシーケンスに回復することでしか治療できず､従来の治療法ではそれは不可能だからである｡しかし､CRISPR/Cas9なら､突然変異したDNAを切断し､相同組換えDNA修復を開始することで遺伝子突然変異を修復できるのである｡ただし､このCRISPR-Cas9ベースの治療法を実現するためには､Cas9､Cas9を特定の遺伝子に導くガイドとなるRNA､ドナーDNAなど必要な材料を安全に細胞に送り届ける手段を開発しなければならない｡
CRISPR-Cas9を細胞に送り込む一般的なテクニックとして､ウイルスを用いる方法があるが､その方法にもいくつも厄介な問題がある｡このCRISPR-Goldの場合にはウイルスを必要としない｡BerkeleyのバイオエンジニアリングのNiren Murthy､Irina Conboy両教授の研究室の指導で行ったこの新研究では､金のナノ粒子を主要材料とするCRISPR-Goldという新しい手法で､Cas9という､DNAに結合切断するタンパク質､ガイドRNA､ドナーDNAをともに生体の細胞に送り込み､遺伝子突然変異を修復できることを実証している｡
「CRISPR-Goldは、ウイルスを使用せずに、遺伝子変異を修正するために必要なCRISPRコンポーネントのすべてを提供することができる送達手段の最初の例です」とMurthy博士は言います。
この研究は、Nature Biomedical Engineeringの2017年10月2日にオンラインで公開されました。
この論文は、「Cas9リボ核タンパク質のナノ粒子送達およびインビボでのドナーDNAはホモロジー指向DNA修復を誘導する」と題されている。
CRISPR-Goldは、ホモロジー指向修復と呼ばれるプロセスによってDNA突然変異を修復する。科学者たちは、突然変異を認識し、DNAを突然変異を是正するRNAガイドであるCas9タンパク質と同じ場所と時間で活動する必要があるため、相同性指向修復ベースの治療法の開発に苦労している。
これらの課題を克服するために、Berkeleyの科学者は、これらの成分をすべて一緒に結合する配送容器を発明し、その容器が多種多様な細胞型の中にあるときにそれらを放出し、相同性指向修復を誘発する。 CRISPR-Goldの金ナノ粒子はドナーDNAをコートしCas9にも結合します。マウスに注射すると、それらの細胞はCRISPR-Goldのマーカーを認識し、その後送達容器を輸入します。
その後、一連の細胞機構を介して、CRISPR-Goldが細胞の細胞質に放出され、分解され、急速にCas9とドナーDNAが放出されます。
Duchenne筋ジストロフィーをモデルとしたマウスの筋肉組織へのCRISPR-Goldの単回注射は、疾患を引き起こすジストロフィン遺伝子の5.4％を野生型または正常な遺伝子配列に回復させた。この補正率はCas9およびドナーDNA単独で処置したマウスよりも約18倍高かったが、0.3％の矯正率しか経験しなかった。
重要なことに、研究者らは、CRISPR-Goldがジストロフィンの正常な配列を忠実に回復したことを指摘している。これは遺伝子の欠損部分のみを取り除き、短くして病気をより軽度の疾患に変換する。
CRISPR-Goldはまた、筋肉が正常に機能しない病気の特徴である組織線維症を軽減することができ、Duchenne筋ジストロフィーを有するマウスにおいて強度および敏捷性を向上させた。 CRISPR-Gold処置マウスは、コントロールを注射したマウスと比較してマウスの強さおよび敏捷性に関する共通の試験において、吊り時間において2倍の増加を示した。
「これらの実験は、CRISPR成分のすべてを同時にカプセル化できるナノ粒子を単に開発することによって、相同性指向修復のプロセスを介して遺伝子突然変異を安全に矯正できる非ウイルスCRISPR治療法を開発することが可能であることを示唆している」Murthy博士前記。
この研究は、Cas9タンパク質送達に対するCRISPR-Goldのアプローチが、毒性に加えて、このDNA切断酵素の連続発現によるCas9の副作用を増幅するCRISPRのウイルス送達よりも安全であることを見出した。研究チームがCRISPR-Goldの遺伝子編集能力をマウスで試験したところ、CRISPR-GoldはDNA損傷を最小限に抑えながらDuchenne筋ジストロフィーを引き起こすDNA変異を効率的に是正することが分かった。
研究者らは、CRISPR-Goldの標的外DNA損傷を定量化し、CRISPRに曝露されなかった典型的な細胞（0.005-0.2％）における典型的なDNA配列決定エラーの損傷レベルと類似の損傷レベルを見出した。可能な免疫原性を試験するために、CRISPR-Gold注射の24時間後および2週間後にマウスの血流サイトカインプロフィールを分析した。 CRISPR-Goldは、複数回の注射または体重減少後の血漿中の炎症性サイトカインの急激なアップレギュレーションを引き起こさず、CRISPR-Goldを安全に複数回使用することができ、筋肉における遺伝子編集の治療ウインドウが高い組織。
「CRISPR-Gold、より広義には、CRISPRナノ粒子は、遺伝子編集ツールのより安全で正確に制御された送達のための新しい道を開く」とDr. Conboyは語った。 「最終的に、これらの技術は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー症や他の多くの遺伝病の新薬に発展する可能性があります。
CRISPR-Goldがヒトの遺伝病の有効な治療法であるかどうかを識別するための臨床試験が必要となるでしょう。研究の共著者であるKunwoo LeeとPark Hyo Minは、CRISPR-Gold技術を人間に翻訳することに重点を置いている新興企業GenEdit（Dr. MurthyがGenEditに所有権を持つ）を結成した。 Murthy博士とConboy博士の研究室では、CRISPRを血流から組織に送達し、成体幹細胞を優先的に標的とする次世代の粒子にも取り組んでいます。これは、幹細胞と前駆細胞細胞は遺伝子編集、自己複製および分化が可能である。
「遺伝病は致命的な死亡率と罹患率を引き起こし、それらを治療する新しい戦略が大いに必要とされている」とDr. Murthyは述べた。 「CRISPR-Goldは、Cas9タンパク質、ガイドRNA、ドナーDNAの非ウイルス性送達を介してインビボで病気の原因となる遺伝子変異を修正することができ、遺伝病の治療薬として発展する可能性がある」と語った。
CRISPR-Goldは、一本鎖ドナーDNAとハイブリダイズし、続いてCas9と複合体を形成し、かつそのエンドソームを破壊するポリマーによってカプセル化された、チオール修飾オリゴヌクレオチド（DNA-チオール）にコンジュゲートした15ナノメートルの金ナノ粒子からなる細胞。
（画像クレジット：Murthy / Conboy / Nature Biomedical Engineering）
【BioQuick News：CRISPR-Gold Delivery Vehicle for CRISPR-Cas9 Fixes Duchenne Muscular Dystrophy Mutation in Mouse Model】
