エーエムアール株式会社より研究支援ツールのご案内
タンパク質間相互作用や抗原/抗体でのコンフォメーショナルエピトープマッピング受託解析
CovalX コンフォメーショナルエピトープマッピング受託解析サービス
- コンフォメーショナルエピトープマッピング
- 水素重水素交換（HDX）質量分析法
- タンパク質複合体の解析
- タンパク質のアグリゲ－ション解析
- タンパク質相互作用の阻害アッセイ
CovalX社は質量分析法を利用した独自のタンパク質複合体、相互作用、エピトープマッピング分析サービスを提供しており、独自のクロスリンキング試薬により非共有相互作用の高精度な分析をすることが可能になりました。
コンフォメーショナルエピトープマッピングサービスではMono Valencyだけでなく、これまでの分析法では困難であったMultiple Valencyをもつ抗体と抗原の相互作用のストイキオメトリーやAntibody integrity、Aggregation（凝集）に関する情報を得ることができます。
CovalX コンフォメーショナルエピトープマッピング受託解析サービスの詳細について
水素重水素交換（HDX）質量分析法
高分解能MSによりタンパク質の立体構造や複合体の相互作用部位（エピトープ）解析を行います。
タンパク質複合体の解析
- タンパク質のサブユニット解析
- タンパク質の多量体形成解析
- PEGylatedタンパク質解析
-
抗原 / 抗体のキャラクタリゼ-ション、 結合のストイキオメトリ-解析、サンドイッチアッセイ解析
タンパク質のアグリゲーション解析
サンプル中のニ量体、三量体、多量体のストイキオメトリ-及び相対比較定量解析
タンパク質相互作用の阻害アッセイ
- 低分子化合物、ペプチドなどによる タンパク質相互作用阻害アッセイ IC50 分析
- 相互作用阻害化合物のハイスループットスクリーニング
コンフォメーショナルエピトープマッピング
STEP1
抗体及び抗原単体でのキャラクタリゼーション解析
（納期 約1週間）
↓
STEP2 抗体 - 抗原複合体のキャラクタリゼーション(ストイキオメトリー)解析H
（納期 約2週間）
↓
STEP3 抗体 - 抗原複合体のキャラクタリゼーション3(コンフォメーショナル-リニアエピトープ)解析
（納期 約1週間）
↓
STEP4 クロスリンクMS解析
（納期 約2週間）
↓
STEP5 コンフォメーショナルエピトープのインターフェースマッピング及びデータ解析
（納期 約2週間）
STEP1 抗体及び抗原単体でのキャラクタリゼーション解析
High-Mass MALDI mass spectrometryによる抗体及び抗原単体でのアグリゲーション解析（各サンプルの濃度を希釈し、クロスリンカーを用い凝集体形成有無の確認）を行います。【納期…約1週間】
一次サンプルスクリーニング
エピトープの高分解能解析には一次スクリーニングに高質量マトリックス支援レーザー脱離イオン化（High-Mass MALDI）で抗体・抗原・および完全な抗体/ 抗原複合体を利用します。これにより抗原・抗体複合体が明らかになり、スタンダードおよびターゲットのタンパク複合体形成が確認されます。
STEP2 抗体-抗原複合体のキャラクタリゼーション（ストイキオメトリー）解析
High-mass MALDI Mass spectrometryによる抗体-抗原複合体のキャラクタリゼ―ション解析（クロスリンカーを用い抗体-抗原複合体のストイキオメトリー解析）を行います。【納期…約2週間】
STEP3 抗体-抗原複合体のキャラクタリゼーション（コンフォメーショナル-リニアエピトープ）解析
エピトープがリニアか、コンフォメーショナルを形成しているかの確認を行います。抗原を酵素消化して得られたペプチドを抗体と共にインキュベーションした後、インタクトな抗原とクロスリンカーを用い反応させ抗体-抗原複合体の形成有無を確認します。【納期…約1週間】
①抗体-抗原複合体を形成しなかった場合 …リニアエピトープであるため、STEP3 リニアエピトープマッピングが最終段階になります。
②抗体-抗原複合体を形成した場合 …コンフォメーショナルエピトープ（ループ、三次構造等）を形成している為、STEP4の解析に進みます。
コンフォメーションの迅速判定
エピトープマッピングの方法は抗原抗体間の非共有結合性相互作用、すなわちエピトープがリニアか立体配座を持つかにより変化します。 抗原が直鎖の配列に基づいて抗原を認識する場合はエピトープもリニアですが、抗原を三次構造に基づいて認識する場合、エピトープは立体配座を持ちます。CovalXは高速の質量分析法を有しており、エピトープの特徴部位を高速で決定することが可能です。 特性評価には競合アッセイを実施します。
①抗原の配列情報を広くカバーするため抗原をトリプシン消化し、その後過剰な抗原のトリプシン消化物・インタクトな抗原およびモノクローナル抗体を混合します。CovalX独自の架橋キットにより複合体を安定化します。
②高質量マトリックス支援レーザー脱離イオン化（High-Mass MALDI）-ToF検出器で分析します。High-Mass MALDI分析で免疫複合体が検出されなければ、特性評価するエピトープはリニアであると特定され、免疫複合体が検出されればコンフォメーショナルのエピトープの存在が示唆されることになります（図1）。
（Nazabalら. Anal. Chem.; 2006; 78（11）; 3562-3570; Bich Cら. Anal. Biochem.; 2008年; 375:35-45）
STEP4 クロスリンクMS解析
NanoLC-Orbitrapによる抗原のPMF解析を行います。複数の酵素を用いシーケンスカバレッジを最大限まで高めます。D0/D12 Labeling: クロスリンクされた抗原のPMFとシーケンスカバレージ解析。【納期…約2週間】
STEP5 コンフォメーショナルエピトープのインターフェースマッピング及びデータ解析
NanoLC-Orbitrapによるクロスリンクされた抗体-抗原複合体のPMF解析後、独自の相互作用解析 ソフトウェアにより、クロスリンクペプチドを検出し、最終報告書のご提出します。【納期…約2週間】
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CovalX コンフォメーショナルエピトープマッピング受託解析サービスのお役立ち資料
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CovalX クロスリンク質量分析法によるコンフォメーショナルエピトープマッピング
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