DNAシーケンスによって遺伝子の変異を検知することは、がんの診断や治療法の選択に大変有用である。現行のDNAサンプルのテスト法では、とりわけサンガー法とパイロシーケンス法が使用されるが、時折、配列への読み替えが困難であったり出来なかったりする複雑な配列パターンが見受けられる。ジョンズ・ホプキンス大学医学部の研究グループは、そのような複雑な遺伝子変異配列パターンであっても、より正確に同定できるパイロメーカーというフリーソフトを開発した。
パイロメーカーはWebベースのアプリケーションで、ユーザーの入力した、例えば腫瘍細胞と正常細胞の比率や、ワイルドタイプのシーケンスデータや、ディスペンセーション順位や、変異配列番号などのデータを基にパイログラムのシミュレーションを行なうものだ。パイロメーカーは、変異とワイルドタイプとの相対アレル比率を計算し、ディスペンセーション配列に存在する予測される当該変異点を導き出す。最終結果は予測されるパイログラムが表示されるようになっている。
KRAS遺伝子は、様々な癌の病因として重要な作用を担っているが、研究グループは、このKRAS遺伝子によく見受けられる変異の幾つかを含む実際のパイログラムを用いて、パイロメーカーを評価した。実際のパイログラムと計算上のパイログラムは、全ての遺伝子変異解析テストにおいて、同一の結果を導出できる結果であった。
彼らは次に、12-13個の単一或いは複合変異のコドンが、独特なパイログラムを描くことを実証した。しかし、いくつかの複合変異は、一塩基変異と見分けがつかない場合もあったため、複合変異の解析はまだ完全ではないと考えられる。研究グループは、二つのパイログラムを使って、最初には解読が困難であった場合の解決法を5通り提案した。それらは、サンガーシーケンス法のみで行なうこと、パイロメーカーで予測配列解析を行なうこと、パイロメーカー反復変異再現法を用いること、メルティングカーブの解析を行なうこと、そしてサンガー法によるTAクローニングを行なうことなどである。
ジョンズ・ホプキンス大学医学部の病理学と腫瘍学の教授で、分子診断学研究所の副所長であり、本論文の上級著者である、ジェームス・R・エシュルマン博士は、「ユーザーの設定条件に応じた予測値が得られるということは、実際のデータと、パイロシーケンス法やサンガー法による曖昧な結果とを比較検討する際に、追跡比較をシミュレートするために大変有用なのです。また、パイロメーカーはポリシーケンシングの複雑な結果を、素早く効率よく解読することも出来るのです。」と説明する。この二つのアイデアは、複雑な遺伝子変異の解読に大変有用となるであろう。TAクローニングとシーケンシングも曖昧ではない解読のためには必須の技術であるが、これらは実験者の経験と腕に依存する傾向があり、プラスミドのコンタミが起こったり、結果の報告が遅れたり、臨床検査を行なう目的から考えれば、様々な問題を有している。
「パイロシーケンス法とサンガーシーケンス法は遺伝子変異の多くの場合を解読する有用な方法ではありますが、複合変異の形態によっては、確定的な解読が何一つ出来ない場合もあるのです。」とエシュルマン博士は注釈する。そして「パイロメーカー解析や、TAクローニングとシーケンシングを追加することによって、変異アレルの的確な診断が出来るのです。パイロメーカーはオンラインで無料使用が出来、インターネットを介してパソコンからアクセスできます。パイロメーカーの反復使用によって最も安価で且つ迅速な遺伝子変異解析が出来るのです。」と語る。
この論文はThe Journal of Molecular Diagnostics誌2012年3月号に掲載される予定である。
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