CHOP研究者が、ターゲット指向の長鎖RNAシーケンスのための多機能で低コストの技術を開発

遺伝子からタンパク質への途中で、RNA分子は異なる方法で切断されたり結合されたりすることができます。このプロセスは、オルタナティブスプライシングとして知られており、1つの遺伝子がいくつかの異なるタンパク質をコードすることを可能にします。オルタナティブスプライシングは多くの生物学的プロセスで発生しますが、がんのような疾患では異常になることがあり、病原性のRNA分子を生じることがあります。オルタナティブスプライシングがどのように疾患を引き起こす可能性があるのかを理解するためには、1つの遺伝子から出てくるすべてのRNA分子（「トランスクリプトアイソフォーム」として知られる）を正確に把握する必要があります。

その方法の1つとして、「長鎖」RNAシーケンスプラットフォームを使用することが挙げられます。これは、10,000塩基以上の長さのRNA分子をエンドツーエンドでシーケンスし、トランスクリプトアイソフォームの全体をキャッチするものです。しかし、これらの長鎖プラットフォームは、シーケンスの収量が控えめであり、特に臨床設定で、臨床的に有意義な深さでの長鎖RNAシーケンスデータを生成することは非常に高額になる可能性があるため、その普及が阻害されています。ターゲット指向のシーケンスは、シーケンスの前に関心のある特定の核酸配列を濃縮することで、事前に定義されたターゲットのカバレッジを大幅に向上させる有用な戦略ですが、ターゲットのキャプチャのコストと複雑さが、より広範囲な使用の障壁となってきました。

「ターゲット指向の長鎖RNAシーケンスは、任意の遺伝子セットのRNAレパートリーを解明するための強力な戦略です。しかし、フルレングスのRNA分子のターゲット指向のシーケンスのための既存の技術は、高価であったりセットアップが難しいため、多くの研究室での利用が難しい」と、共同上級著者であるラン・リン博士（Lan Lin）は述べています。リン博士は、CHOPの病理学および臨床医学助教授、およびRaymond G. Perelman細胞および分子治療センターのメンバーです。

「TEQUILA-seqは、低コストで使いやすいという問題を解決します。この技術は、ユーザーによってさまざまな目的に適応させることができ、研究者はシーケンスしたい遺伝子を選び、自分たちの研究室でターゲットキャプチャのための試薬を作製することができます。これにより、さまざまな疾患に対する新しい診断および治療法の発見が加速する可能性があります。」

ターゲット指向のシーケンスを可能にする1つの方法は、ハイブリダイゼーションキャプチャベースの濃縮と呼ばれるものです。これは、キャプチャプローブとしての核酸の短い断片、オリゴヌクレオチドを使用します。これらのオリゴヌクレオチド（通常は単に「オリゴ」と呼ばれる）は、ビオチン分子でタグ付けされ、核酸配列の補完性に基づいてターゲットとハイブリダイゼーションするように設計されています。これにより、生物学的サンプルからのターゲット配列の簡単なキャプチャと分離が可能になります。しかし、ハイブリダイゼーションキャプチャベースの濃縮は、ターゲット指向のシーケンスのための効率的な方法であるにもかかわらず、商業的に合成されたビオチン化キャプチャプローブは高価であり、限られた数の反応のためにしか使用できないため、キャプチャ反応ごとのサンプルコストが高くなります。

この制約を解消するために、CHOPの研究者たちは、TEQUILA-seq（トランスクリプトエンリッチメントおよびクォンティフィケーションを利用したイソサーマルリニアアンプリファイドプローブと長鎖シーケンスを組み合わせたもの）を開発しました。TEQUILA-seqの主要な革新は、ニッキングエンドヌクレアーゼに引き起こされるイソサーマル鎖置換増幅反応であり、これにより、テンプレートとしての非ビオチン化オリゴの安価なプールからビオチン化キャプチャプローブの大量を合成することができます。研究者は、テンプレートオリゴの入力としてわずか2ngしか使用せず、少なくとも250のキャプチャ反応に使用できる25ugのTEQUILAプローブを生成することができます。キャプチャプローブを合成するためのこの革新的な戦略により、TEQUILA-seqは大規模なターゲットパネルや多くの生物学的サンプルに対して高いコスト効果を持ち、スケーラブルとなります。

その性能を基準として、研究者は合成RNAや人間のRNAに対して複数の遺伝子パネルのためのTEQUILA-seqを実行しました。TEQUILAプローブは、ターゲットキャプチャおよび濃縮において、商業キャプチャプローブと同様の性能を持ちながら、キャプチャ反応ごとに数百倍安価でありました。さらに、研究者は、TEQUILA-seqが、ターゲットRNA分子の検出を大幅に向上させながら、定量を維持することができることを示しました。

「安価な試薬と簡単な実験的ワークフローを使用して、TEQUILA-seqにより、多くの生物学的サンプルにわたる任意の遺伝子セットのフルレングスRNA分子を深くシーケンスすることができます」と、共同上級著者のイー・シン博士（Yi Xing）は述べています。シン博士は、CHOPの計算生物学およびゲノム医学センターのディレクターです。「これは非常に興奮するものであり、RNAガイドの遺伝的診断から治療法の開発まで、幅広い医療応用が可能となります。」

その生物医学的な有用性を示すために、研究者は、40の乳がん細胞株にわたる468のアクショナブルながん遺伝子のフルレングスRNA分子をプロファイルするためにTEQUILA-seqを適用しました。彼らは、広く研究されてきたがん遺伝子において、以前には知られていなかったトランスクリプトアイソフォームを発見しました。これは、がんから体を保護する遺伝子が個々の腫瘍でどのように不活性化されるかに関する新しい洞察をもたらす可能性があります。

「私たちの研究は、TEQUILA-seqがフルレングスRNA分子のターゲット指向のシーケンスのために幅広く使用できることを示しています」と、リン博士は述べました。「さらに、TEQUILAプローブは、一般的な目的のキャプチャプローブです。これらは、ターゲット指向のRNAおよびDNAシーケンスの両方、および長鎖および短鎖シーケンスプラットフォームの両方に対応しています。低コストで簡単に大量のビオチン化キャプチャプローブを任意のターゲットパネルに対して容易に生成する能力は、多くの基礎、トランスレーショナル、および臨床応用のための大規模および人口レベルの研究を容易にすることができます。」

[News release] [Nature Communications article]