CRISPRを基盤としたツールは、疾患関連遺伝子変異を標的にする能力に革命をもたらした。 CRISPRテクノロジーは、Cas9およびCas12酵素でDNAをターゲットにすることや、Cas13酵素でRNAをターゲットにすることなど、遺伝子とその発現を操作するツールファミリーとして成長している。 このラインナップは、突然変異に取り組むためのさまざまな戦略を提供する。
比較的一過性の疾患関連RNA変異を標的にすれば、ゲノムに永続的な変更を加えることを避けることができる。 さらに、ニューロンなどの一部の細胞タイプは、CRISPR/Cas9を介した編集が難しく、脳に影響を与える壊滅的な疾患を治療するための新戦略が必要だ。
マクガヴァン脳研究所の研究者そしてハーバード大学とMITが共同で運営するブロード研究所のコアメンバーであるFeng Zhang博士（写真）と彼のチームは、RESCUE（RNA Editing for Specific C to U Exchange）と呼ばれる戦略を開発した。 Scienceの2019年7月26日号に掲載されたこの論文のタイトルは、「プログラム可能な単一塩基RNA編集のためのシトシンデアミナーゼ（A Cytosine Deaminase for Programmable Single-Base RNA Editing.）」と題されている。
筆頭共著者であるOmar Abudayyeh 博士とJonathan Gootenberg 博士（現在、二人ともマクガヴァンのフェロー）を含むZhang 博士と彼のチームは、非活性化されたCas13を使用してRESCUEをRNA転写産物の標的シトシン塩基に導き、 望ましくないシトシンをウリジンに変換する新規の進化したプログラム可能な酵素により、RNAの指示を変更した。
RESCUEは、Zhang博士のチームによって開発されたRNAのアデニン塩基をイノシンに変換する技術であるREPAIRに基づいている。 RESCUEは、CRISPRがリン酸化部位などタンパク質の変更可能な位置をコードしたRNAをターゲットにできる条件を拡大した。 このような部位は、タンパク質活性のオン/オフスイッチとして機能し、特にシグナル伝達分子および癌関連パスウェイによく見られる。
「病気を引き起こす遺伝的変化の多様性を治療するには、選択するための一連の正確な技術が必要だ。この新しい酵素を開発し、CRISPRのプログラム可能性と精度と組み合わせることで、このツールボックスの重大な溝を埋めることができた。」と、MITのthe James and Patricia Poitras神経科学教授のZhang博士は語った。 Zhang博士は、MITの脳科学および認知科学および生物工学部門にも任命されている。
RNA編集の範囲を新しいターゲットへ拡大
以前開発されたREPAIRプラットフォームは、特定のRNA転写産物に対するRNAエディターのアクティブドメインADAR2に向けRNAターゲティングCRISPR/Cas13を使用し、ヌクレオチド塩基のアデニンをイノシン（AからI）に変換した。 Zhang 博士と同僚はREPAIRフュージョンについてシトシンをウリジン（CをU）に変換するように進化させた。
RESCUEは任意のRNAに導かれ、進化したADAR2コンポーネントを介してCからUへの編集を実行することができる。 チームは新しいプラットフォームをヒト細胞に取り入れ、細胞内のRNAと臨床的に関連した24の合成RNAの変異を標的にできることを示した。 次に、RESCUEをさらに最適化して、オンターゲット編集の混乱を最小限に抑えつつ、オフターゲット編集を減らした。
新しいターゲット
RESCUEによるターゲティングの拡大により、リン酸化、グリコシル化、メチル化などの翻訳後修飾により多くのタンパク質の活性と機能を調節する部位を、より簡単に編集対象にすることができる。
RNA編集の主な利点は、DNAレベルで行われる永続的な変更とは対照的に、その可逆性にある。 したがって、RESCUEは、永続的にではなく一時的に変更が必要な場合に役立つ。
これを実証するために、研究チームは、ヒト細胞において、RESCUEがリン酸化されることが知られているタンパク質産物のβ-カテニンをコードするRNAの特定の部位を標的とし、β-カテニンの活性化と細胞増殖を一時的に増加させることを示した 。 そのような変更が永続的に行われた場合、細胞は制御不能な細胞成長と癌になりやすくなるが、RESCUEを使用することで、一時的な細胞成長が急性損傷に応じた創傷治癒を促進する可能性がある。
研究者はまた、病原性遺伝子変異体であるAPOE4も標的にした。 APOE4対立遺伝子は、遅発性アルツハイマー病の発症の遺伝的危険因子として一貫して出現している。 アイソフォームAPOE4は、2つの違い（APOE4のCとAPOE2のUの両方）だけがリスク要因ではないAPOE2と異なる。 Zhang博士らは、リスク関連APOE4 RNAを細胞に導入し、RESCUEがそのCをAPOE2シーケンスに変換し、本質的にリスクを非リスクバリアントに変換できることを示した。
加速するためにテクノロジーを共有
RESCUEを臨床へ広めるため、Zhang博士はRESCUEを病気の原因となる突然変異をよりよく理解するためのツールとして使用できるようにしたいと考えている。Zhang博士のラボは、以前に開発されたCRISPRツールと同様にRESCUEシステムを広く共有することを計画しており、このテクノロジーは、非営利のプラスミドリポジトリAddgeneを通じて学術研究に自由に利用できる。 追加情報は、Zhang博士のラボのWebページに記載されている。
BioQuick News:New CRISPR Platform (RESCUE) Expands RNA Editing Capabilities; Enables Cytosine to Uridine Changes; Zhang Team Shows That Technique Can Be Used to Convert APOE4 Alzheimer’s Risk Variant to APOE2 Non-Risk Variant
