私が抗ペプチド抗体をはじめたきっかけは、以前に書いた通り、ペプチド合成機に出会ったからです。１９８０年代後半のことでした。東京大学医科学研究所の三号館地下の一室に鎮座していたアプライドバイオシステムズ社（当時の社名）の４３０A は名機でした。
当時はまだまだ普及していなかった 新しいケミストリー（ Fmoc）にも対応していて、欠点といえば樹脂を攪拌するのがボルテクスミキサーのような動きだったので長鎖ペプチドの合成には不向きだったくらいです。
結局、本機では Fmoc 合成はやらずに、もっぱら tBoc 誘導体を使いました。ペプチドはグラム量を合成できたので抗体作成だけに使うには十分すぎでしたが、とにかく費用がとんでもなくかかって、赴任したての下っ端助手が共通機器の稼働経費を捻出するために委員会の偉い先生方に頭を下げて周ったのを思い出します。
このころの研究テーマは、白血球のスーパーオキシドアニオン産生系でした。特に、この電子伝達系の中心的存在であるb型シトクロム（Cytb）は、大小二種類のサブユニットから構成される膜たんぱく質で、食細胞の形質膜において細胞外の酸素分子に電子を渡すという酸化還元過程の重要な役割を担う分子です。Cytbが機能しないと、白血球は活性酸素を作れなく殺菌能が低下するので、重篤な易感染性を示すことになり、先天性疾患として慢性肉芽腫症（CGD; Chronic Granulomatous Disease）が知られています。上司（教授）からCytbの抗体を作るように言われ、ペプチド合成機の出番となったわけです。
Cytbは、複雑な膜内在性たんぱく質であり、精製や組換たんぱく質の発現が難しいことが予想されたため、方針は迷わず抗ペプチド抗体でした。
さて、当然のことだったかもしれませんが、周囲には抗ペプチド抗体をやれる研究者はおらず、サポートなしのド素人としてスタートしました。
非常識その１：L１２３---Cytbの大サブユニットには糖鎖がついていて、この付近は細胞外に露出していると考えられます。細胞の外からアクセスできる抗体があったら便利だな。今から考えると、とんでもなく失敗に近づく選択でしたが、当時は真面目でした。のちに書いた実験書には、「細胞の外側に出ている部分は、抗体ができにくいので、なるべく避ける」と記載しました。L１２３のL１は、大サブユニットの１番目の（最初に作った）ペプチドという意味です。２３は残基数です。少し長めでしたね。２３残基をtBoc合成してHPLC精製、凍結乾燥するとふわふわのいい感じの出来でした。しかし、キャリアのヘモシアニンと結合させるために水溶液にしてしばらく置くと、変！ 固まっている？ 何度試みてもゲル状になっています。結局、ヘモシアニンへの結合は諦め、ダメ元でそのまま免疫することにしました。短いペプチドをそのまま動物に投与しても抗体ができなくて当たり前ですが、微妙な残基数だったようです。このように、とんでもないやり方で進めた抗ペプチド抗体でしたが、幸運にも免疫した何羽かのウサギのうち１羽だけ、期待した抗体を作ってくれたのは奇跡的です。
ただし、この抗体は、大学院生が大胆に使い切ってしまい、幻のL１２３抗体となりました。あわてて、ウサギを追加し、同じ抗体を作ろうとしましたが、うまくいかず、綱渡り的な実験であったことが判明しました。非常識その２：SN-----Cytbの大小両サブユニットのN末端付近は疎水性が高く、生体膜あるいはたんぱく質分子の内部に埋没していると考えられます。ペプチドを合成した後、どのように扱いかも考えずに、化学合成しました。４３０Aは忠実にプログラムを実行し、アミノ酸誘導体は樹脂に付加されたようです。脱保護をしてトリフルオロ酢酸には溶けていました。
しかし、うすめると白濁、HPLCにもかかりません。精製ができないので、これはアウトかなと諦めかけたのですが、やはりダメ元、ドロドロのままアジュバントとまぜて免疫、一ヶ月後にIgGは上昇しています。さて、どうやって抗体を精製しようか、抗原のペプチドは純化できません。考え倦んだ末、N末端の短いペプチドを合成してHPLKC精製、ペプチドカラムを作りました。SN抗体は、Cytb小サブユニットのN末端領域を認識する抗体です。後の切断部位特異抗体への布石のようにも思えます。L123とSNは、論文に発表済みです。
ただし、上記のような非常識な記載は全くなく、何事も計画的に進めたように書かれています。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1730586Imajoh-Ohmi, S., Tokita, K., Ochiai, H. et al. (1992) Topology of cytochrome b558 in neutrophil membrane analyzed by anti-peptide antibodies and proteolysis. J Biol Chem 267: 180–184.
