CRISPR-Cas9遺伝子編集システムは、合成生物学における革新的な技術の申し子となっているが、いくつかの大きな限界がある。CRISPR-Cas9は、特定のDNA断片を見つけて切断するようにプログラムされているが、DNAを編集して目的の変異を作り出すには、細胞をだまして新しいDNA断片を使って切断部分を修復する必要がある。Cas9はしばしば意図しない標的外の部位も切断してしまうため、この「ベイト＆スイッチ」は操作が複雑で、細胞にとって有害な場合もある。
一方、組み換え技術と呼ばれる遺伝子編集技術では、細胞がゲノムを複製している間に別のDNAを導入することで、DNAを切断することなく効率的に遺伝子変異を生じさせることができる。この方法は単純なので、一度に多くの細胞で使用することができ、研究者は複雑な変異のプールを作ることができる。しかし、これらの変異の影響を解明するためには、それぞれの変異体を分離し、配列を決定し、特性を明らかにする必要があるが、これは時間のかかる非現実的な作業である。
ハーバード大学Wyss研究所 Biologically Inspired Engineeringとハーバード・メディカル・スクール（HMS）の研究者は、この作業を容易にするRetron Library Recombineering (RLR)と呼ばれる新しい遺伝子編集ツールを開発した。RLRは、最大で数百万個の変異を同時に生成し、変異細胞を「バーコード」化することで、プール全体を一度にスクリーニングし、大量のデータを簡単に生成・分析することができる。この成果は、バクテリアの細胞で達成されたもので、PNAS誌2021年5月4日号に掲載された論文に記載されている。この論文は「生体内で一本鎖DNAを作製してハイスループットな機能的変異のスクリーニングを行う（High-Throughput Functional Variant Screens Via in Vivo Production of Single-Stranded DNA）」と題されている。
Wyss・コア・ファカルティのGeorge Church博士（写真）の研究室でポスドクをしている共同第一著者のMax Schubert博士は、「RLRは、バクテリアのゲノムをランダムに切り刻み、それらの遺伝子断片をその場で一本鎖のDNAに変え、それを使って何百万もの配列を同時にスクリーニングするという、CRISPRでは不可能なことを可能にしてくれた。RLRは、高度に多重化された実験に使用できる、よりシンプルで柔軟な遺伝子編集ツールであり、CRISPRでしばしば観察される毒性を排除し、研究者がゲノムレベルで変異を探索する能力を向上させることができる」と述べている。
Retron：エニグマからエンジニアリングツールへ
Retronは、バクテリアのDNAの断片で、逆転写を受けて一本鎖DNA（ssDNA）の断片を作り出す。Retronの存在は何十年も前から知られていたが、Retronが生成するssDNAの機能については、1980年代から2020年6月まで科学者たちを当惑させていた。
あるチームがついに、RetronのssDNAはウイルスが細胞に感染したかどうかを検出し、CRISPR-Cas9もそうであるように、バクテリアの免疫システムの一部を形成することを解明した。
当初、Retronはバクテリアの不思議な癖と考えられていたが、CRISPRと同様に、バクテリアや酵母、さらにはヒトの細胞において、正確で柔軟な遺伝子編集に利用できるということで、ここ数年、研究者たちの関心が高まっている。
「長い間、CRISPRはバクテリアが行う奇妙なものとしか考えられていなかったが、それをゲノムエンジニアリングに利用する方法がわかったことで、世界が変わった。Retronは、バクテリアによるもう一つのイノベーションであり、重要な進歩をもたらすかもしれない」とSchubert 博士は述べている。Schubert博士がRetronに興味を持ったのは数年前のことで、その理由は、バクテリアの中でssDNAを作ることができるという、オリゴヌクレオチド組み換えと呼ばれる遺伝子編集プロセスに利用できる魅力的な特徴にあった。
組換えによる遺伝子編集技術では、目的の変異を含むssDNAを生物のDNAに組み込む必要があるが、これには2つの方法がある。二本鎖DNAを物理的に切断し（CRISPR-Cas9など）、細胞が修復過程で変異配列をゲノムに組み込むように誘導する方法と、変異DNA鎖と一本鎖アニーリングタンパク質（SSAP）を複製中の細胞に導入し、SSAPが娘細胞のDNAに変異鎖を組み込むようにする方法である。
共同研究者の Daniel Goodman 博士は、Wyss研究所の元グラデュエート・リサーチ・フェローで、現在はカリフォルニア大学サンフランシスコ校（UCSF）のジェーン・コフィン・チャイルズ・ポストドクトラル・フェローを務めている。
Retronのもう一つの魅力は、その配列自体が、細菌のプールの中でどの個体がRetronの配列を受け取ったかを識別する「バーコード」の役割を果たすことで、正確に作成された変異株のプールスクリーニングを劇的に高速化できることである。
Schubert博士らは、実際にRetronを使って効率的な組み換えを実現できるかどうかを確認するために、まず、Retron配列内に配置された抗生物質耐性遺伝子と、Retron配列の細菌ゲノムへの組み込みを可能にするSSAP遺伝子を含む細菌DNAの円形プラスミドを作成した。このRetron・プラスミドを大腸菌に挿入し、20世代の細胞複製後に遺伝子が正常にゲノムに組み込まれるかどうかを調べた。当初、Retron組換えシステムを搭載した大腸菌のうち、目的の変異を組み込んだものは0.1％以下だった。
この期待外れの初期性能を改善するために、研究チームはバクテリアの遺伝子にいくつかの改良を加えた。まず、細胞が本来もっているミスマッチ修復機構を不活性化した。ミスマッチ修復機構は、DNAの複製エラーを修正するもので、目的の変異が次世代に受け継がれる前に「修正」することができる。また、自由に浮遊しているssDNAを破壊する酵素であるエキソヌクレアーゼをコードする2つの遺伝子も不活性化した。これらの変更により、Retron配列を組み込んだバクテリアの割合は劇的に増加し、個体群の90％以上を占めるようになった。
変異体のネームタグ
RetronのssDNAが細菌のゲノムに組み込まれていることが確認できので、研究チームは、Retronを遺伝子配列解析の「ショートカット」として利用し、多くの実験を一度に行えるかどうかを検証した。プラスミドにはそれぞれ固有のRetron配列があり、これが「ネームタグ」の役割を果たしていることから、細胞がどのような変異を受けたかを判断するためには、細菌全体のゲノムではなく、はるかに短いRetronのシーケンスが利用できるはずだと考えたのである。
まず、研究チームは、RLRが大腸菌の既知の抗生物質耐性変異を検出できるかどうかを検証した。その結果、これらの変異を含むRetron配列が、他の変異と比較して非常に高い割合で配列データに含まれていることから、RLRは検出可能であることがわかった。また、RLRは、非常に類似した変異に起因する耐性のわずかな違いを測定するのに十分な感度と精度を有していることも明らかになった。重要なことは、個々の変異体を分離して配列を決定するのではなく、細菌のプール全体からバーコードの配列を決定してこれらのデータを収集することで、プロセスを劇的に高速化できることだ。
次に、研究者らは、RLRをさらに一歩進めて、ランダムに断片化されたDNAに使用できるかどうか、また、一度に使用できるRetronの数を調べた。彼らは、別の抗生物質に高い耐性を持つ大腸菌株のゲノムを切り刻み、その断片を用いて、プラスミド中のRetron配列に含まれる数千万の遺伝子配列のライブラリを構築した。
今回の実験では、RLRのシンプルさが際立っていた。というのも、CRISPRでは、各変異を誘発するためにガイドとドナーの両方のDNA配列を合成しなければならないが、RLRでは、より大きなライブラリを構築することができるからだ。
このライブラリを、RLRで最適化された大腸菌株に導入して解析した。その結果、抗生物質耐性を付与するRetronは、プールされた細菌の配列を解析した際に、他のRetronに比べて濃縮されていることから、容易に同定できることが分かった。
Church 博士は、Wyss研究所の合成生物学フォーカスエリアのリーダーであり、HMSの遺伝学教授でもあるが、「この研究は、ゲノム全体の変異の影響や、それらの変異がどのように相互作用するかを観察することを可能にする。この研究は、RLRを他の遺伝子システムで使用するためのロードマップを確立するのに役立ち、将来の遺伝子研究に多くのエキサイティングな可能性をもたらす」と述べている。
CRISPRと異なるもう一つの特徴は、CRISPRの「一発勝負」の手法では、最初の試みで成功するか失敗するかのどちらかになる傾向があるのに対し、RLRでは、希望する変異をゲノムに組み込むことに成功するバクテリアの割合が、バクテリアの複製に伴って時間とともに増加することである。RLRは、CRISPRの編集性能を向上させるためにCRISPRと組み合わせることができる可能性があり、また、CRISPRが有害である多くのシステムにおいて代替手段として使用することができる。
RLRの編集率を向上させ、標準化するためにはさらに多くの作業が必要であるが、この新しいツールに対する期待は高まっている。RLRのシンプルで合理的な性質は、複数の変異がどのように相互作用するかを研究することを可能にし、機械学習を使用してさらなる変異の影響を予測することを可能にする大量のデータポイントを生成することができる。
Wyss研究所の創設者であるDon Ingber 博士は、「この新しい合成生物学のツールは、 ゲノムエンジニアリングの処理能力をさらに向上させるものであり、間違いなく、新しく、刺激的で、 予想外の革新をもたらすだろう」と述べている。Ingber 博士は、HMSおよびボストン小児病院のジュダ・フォークマン血管生物学教授、ハーバード大学ジョン・A・ポールソン工学・応用科学大学院のバイオエンジニアリング教授でもある。Ingber博士は、今回の研究には関与していない。
PNAS論文の他の著者には、HMSのTimothy Wannier氏、ウォーリック大学（英国）のDivjot Kaur氏、マサチューセッツ工科大学のFahim Farzadfard氏とTimothy Lu氏、Gladstone Institute of Data Science and Biotechnology（サンフランシスコ）のSeth Shipman氏が含まれている。
この記事は、Lindsay Brownell氏が執筆したWyssのニュースリリース（4月30日付）に基づいている。
BioQuick News:Move Over CRISPR, the Retrons Are Coming; With New Gene Editing Technique from George Church’s Lab, Millions of Genetic Experiments Can Be Performed Simultaneously; Retron Library Recombineering (RLR) May Overcome Many Limitations of CRISPR-Cas9
