皆さんタグの抗体は実験でお使いかもしれません。His タグ、FRAG タグなど、タグの配列を組換えたんぱく質に入れ込んでおくと、遺伝子導入したたんぱく質を抗体で高感度に検出できるという便利なツールです。
今回は、ペプチドの化学合成でタグとして ジニトロフェニル（DNP)基を導入する方法と抗 DNP 抗体の活用についてです。DNP は代表的なハプテンで、モノクロ、ポリクロにかかわらず使える抗 DNP 抗体がたくさん出回っています。
少しペプチドの化学合成についてお話ししておきます。
ペプチド合成は、固相の自動合成機が普及して、生命科学領域における合成ペプチドの利用が高まりました。
１９８０年代後半のことでしたが、私のような有機化学合成の経験がない専門外の研究者でも合成機の運転と後処理の方法を覚えてしまえば、手軽に化学合成ペプチドを実験に使うことができたわけです。
ペプチドの固相合成では、樹脂の上にアミノ酸誘導体を C 末端から N 末端方向に一個ずつ伸長させます。アミノ酸誘導体は側鎖と骨格の α アミノ基を保護基でプロックしたもので、樹脂に結合したアミノ酸誘導体から保護基を外し α アミノ基をフリーにして、ここに２番目のアミノ酸誘導体のカルボキシ基を活性化して縮合させるサイクルを繰り返していきます。
合成機によるペプチド鎖の伸長の段階では、N 末端に位置する α アミノ基だけが逐次遊離状態になり、側鎖の保護基は基本的に保たれています。自動合成によるペプチド鎖伸長が終わると、樹脂からペプチドを外すと同時に側鎖の保護基も除去します。こうして遊離させたペプチドを HPLC などで精製して実験に使います。
当初の合成機では、α アミノ基が t-butyloxycarbonyl （Boc)基で保護されたアミノ酸誘導体を用いましたが、より温和な条件下での fluorenyl-methoxycarbonyl基で保護する Fmoc 法に変わり、合成ペプチドの質が向上しました。使用するアミノ酸誘導体も tBoc 法と Fmoc 法では異なり、tBoc 法 でアミノ酸を一個つけるごとに外していた tBoc 基を、Fmoc 法では一部の側鎖に使えるようになりました。DNP タグをペプチドに導入するために、tBoc 合成用の Boc-His(DNP)-OH を使います。Boc-His(DNP)-OH は、ヒスチジンのイミダゾール基を DNP で保護した誘導体で、αアミノ基は tBoc で保護されています。この Boc-His(DNP)-OH を Fmoc 合成の最後のアミノ酸として結合させます。
すなわち、N 末端に Boc-His(DNP)-OH が入った形で合成が終了します。Fmoc 合成での脱保護操作で tBoc 基は外れますが、DNP 基は遊離しません。N 末端に DNP がタグとして入ったペプチドが得られるわけです。Boc-His(DNP)-OH は今はあまり使いませんが、安価なアミノ酸誘導体なので、手軽にタグ導入が合成レベルでできます。 こうして作ったペプチドを、例えば相互作用分子の探索に使う実験では、市販の抗 DNP 抗体で標的分子が検出可能です。
