最初にエドマン分解を利用したプロテインシークエンサーによるタンパク質同定法について述べたい。プロテインシークエンサーではN末端のαアミノ基をPITCで修飾することからエドマン分解が始まるので、N末端αアミノ基がフリーでなければならない。プロテインシークエンサーではタンパク質を電気泳動後にPVDF膜に転写できれば、10ピコモル程度でN末端から10残基程度のアミノ酸配列を決定することは比較的容易である。
しかしながら、自然界の多くのタンパク質はN末端が修飾されているので、プロテインシークエンサーで配列を決定するためにはプロテアーゼでペプチド断片を調製する必要がある。
エドマン分解で得られるアミノ酸配列は結論的な結果であるので、質量分析全盛の今でも用途を選ぶことで非常に有用な解析手法である。タンパク質の正確な配列決定に加えて、限定分解部位の決定や糖鎖などの修飾部位の特定に有用である。さらにアミノ酸配列のβ転移有無の確認やタンパク質の純度検定にも利用できる。さて、プロテインシークエンサーでうまく配列決定するためのポイントは、サンプルの純度である。ひとことで純度といっても、多くの要素が含まれる。例えば、目的タンパク質の純度、電気泳動で単一にみえるバンドであっても別のタンパク質が含まれていれば複数のアミノ酸が検出されて配列決定が困難となる。
さらに、N末端アミノ酸が均一であること。目的タンパク質が高純度であっても、プロセッシング等によりタンパク質のN末端が不均一になっていることはよくある。この場合も複数のアミノ酸が検出されて配列の決定が困難になる。次に人為的なコンタミネーションの例を挙げる。電気泳動で単一のバンドをPVDF膜へ転写、染色・脱色、切り出しの操作中にケラチンが汚染することがある。
また、電気泳動後の操作に使用する容器をウエスタンブロッティングと併用していたために、カゼインやアルブミンが汚染されていたという例もある。このような汚染を避けるために、試薬、ガラス板、容器などのすべてについて配列分析専用とすべきである。より高感度な質量分析ではさらに気を付けなければならない。また、電気泳動中にN末端が修飾される可能性がある。これを避けるために、作成したゲルはすぐに使用するのではなく翌日以降に使用する。陰極側の泳動バッファーにチオグリコール酸ナトリウムなどのラジカルスカベンジャーを加えることで、N末端の修飾反応を抑制する。この場合、システイン残基のアクリルアミド付加反応が抑制されることに留意すべきである。現在ではプロテインシークエンサーを使って、10ピコモルのサンプルがあれば10残基程度の配列は十分に決定することが可能である。あとは分析者の腕によって、1ピコモルの配列決定ができたり、解析不能データから配列が決まったり、数十残基の配列が読めたりするから不思議である。このためにも日々の装置のメンテナンスを怠らず、装置のクセを知ってデータを読みこなす経験とノウハウを蓄積する努力が大切である。
最後に、決定した配列をデータベース配列に対してホモロジーサーチを実施することでタンパク質を特定する。データベースに登録されていないタンパク質の場合は、遺伝子を取り出すためのプローブとして利用することができる。これまでに多くのタンパク質のアミノ酸配列決定を経験してきたが、決定した配列がときどきデータベースに登録された配列と異なることがある。塩基配列の読み間違い、バリアントやアイソフォームの存在などが原因として考えられるが、プロテインシークエンサーによるタンパク質同定では質量分析で見過ごすような1アミノ酸の違いが明確になる。なお、アプライドバイオシステムズがプロテインシークエンサー市場から撤退することは残念でならない。プロテインシークエンサーの必要性を考えれば、最後の国内メーカーに今後も頑張っていただきたい。
