siRNAトランスフェクション条件最適化プレート

トランスフェクションプレートとは

サイトパスファインダーのトランスフェクションプレートは、核酸、トランスフェクション試薬、アクセラレーターからなる複合体をプレートウェル上にプレコーティングしてあり、細胞を播種するだけの簡単な操作で直ぐにトランスフェクションを行うことができます。

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特許技術「アクセラレーター」とは

サイトパスファインダーの特許技術であるアクセラレーター（導入促進剤）を添加してあり、従来のトランスフェクション試薬よりも高効率で核酸の導入が期待できます。

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遺伝子導入効率を上げるサイトパスファインダーの技術とは

サイトパスファインダーは、細胞外マトリクスタンパク質（*）などの「遺伝子導入促進剤」を用いる独自の固相トランスフェクション技術を開発することにより、遺伝子導入効率を飛躍的に高めることに成功しました。
遺伝子導入促進剤の開発により、適用可能な細胞種が広がり、遺伝子導入効率が低くてお悩みの細胞でのトランスフェクション実験を可能にします。

*　細胞外マトリクスタンパク質による遺伝子導入促進作用につきましては、細胞内ストレスファイバー誘引作用が引き金となって、細胞とDNA(RNA)層間の相互作用が増強されるメカニズムによるものと考えられます。

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他の方法との比較

• 再現性が高い
• 適応可能な細胞が多い
• 96～1536ウエルプレートで実施可能
• ダブルノックダウン可能

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レイアウト例(384ウェルプレート)

下の図はsiRNAトランスフェクション最適化キット・384ウェルプレートタイプのレイアウト例です。

(参考価格: 30,000円/1枚)

• blankは主にプレートのエッジ効果を回避するためのもので、条件検討の評価には使用しません。
• UTはトランスフェクション複合体を含まない無処置群で、陰性対照のsiRNAと比較することによって各トランスフェクション条件による細胞毒性を見積もるために使います。
• 001～140はsiRNA量と遺伝子導入試薬の種類、濃度を変化させた各種条件に対応します。同じ条件番号が2ウェルずつあるのは陰性対照siRNAと細胞死を誘導する陽性対照siRNAがそれぞれ入っているためです。また4色に色分けされているのは、それぞれバッファとsiRNAの濃度が異なるためです。

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プレート操作方法

1. ご使用の15～20分前に冷凍庫からプレートパックを取り出し、安全キャビネット内等で室温に戻します（※パックは室温に戻るまで開封しないでください）。
2. 細胞懸濁液を準備します。
3. ディスペンサーまたはマルチチャンネルピペットで適量の細胞懸濁液をプレートに分注します。
4. プレートを10秒間（30xg、室温）遠心処理してください。
5. インキューベーター内で静置培養します。
6. プレートリーダー等で生細胞を測定します。
7. アッセイデータを解析ソフトTFCVのスプレッドシートにコピー＆ペーストし、計算を行います。

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技術開発に関する論文

1. Uchimura, E., Yamada, S., Fujita, S., Miyake, M., Miyake, J. (2009) Reverse Transfection Using Gold Nanoparticles; Micro and nano technologies in bioanalysis; Methods and protocols. Method in Mol Biol., Lee, J. W. and Foote, R. S. eds. Humana Press, 544, 609-616
2. Highly Efficient Reverse Transfection with siRNA in Multiple Wells of Microtiter Plates. S.Fujita, E. Ohta, C. Sasaki, K. Takano, M. Miyake, J. Miyake. J. Biosci. Bioeng. 104, 329-333 (2007).
3. Universal design of reverse transfection using antibodies against cell surface antigen. E. Uchimura, S. Yamada, E. Nomura, K. Matsumoto, S. Fujita, M. Miyake, J. Miyake, J. Biosci. BIoeng, 104, 152-135 (2007).
4. A Method for Reverse Transfection Using Gold Colloid as a Nano-Scaffold. Uchimura, E., Yamada, S., Uebersax, L., Fujita, S., Miyake, M.*, Miyake, J. J. Biosci. Bioeng., 103, 101-103 (2007).
5. Mechanical immobilization of Hela cell on aligned carbon nanotube array. A Ago, E. Uchimura, A. Saitoh, T. Oshima, N. Ishigami, M. Tsuji, M. Yumura, M. Miyake, Materials Lett. 60, 3851-3854 (2006).
6. On-chip transfection of PC12 cell based on the rational understanding of the role of ECM molecules: efficient, non-viral transfection of PC12 cell using collagen IV. Eiichiro Uchimura, Shigeru Yamada, Lorenz Uebersax, Tomohiro Yoshikawa, Kayo Matsumoto, Michiko Kishi, Daniel P.Funeriu, Masato Miyake, Jun Miyake. Neuroscience Letters. 378(1),40-43 (2005).
7. Transfection microarray of nonadherent cell on an oleyl poly (ethylene glycol) ether-modified glass slide. Koichi Kato, Kohei Umezawa, Masato Miyake, Jun Miyake, and Teruyuki Nagamune. BioTechniques 37:444-452 (2004)
8. Transfection microarray of human mesenchymal stem cell and on-chip siRNA gene knockdown. Tomohiro Yoshikawa, Eiichiro Uchimura, Michiko Kishi, Daniel P. Funeriu, Masato Miyake, Jun Miyake. Journal of Controlled Release 96, 227-232 (2004).
9. Immobilized culture of nonadherent cell on an oleyl poly(ethylene glycol) ether-modified surface. Koichi Kato, Kohei Umezawa, Daniel Petru-Funeriu, Masato Miyake, Jun Miyake, Teruyuki Nagamune. BioTechniques 35 (5), 1014-1021 (2003).
10. 三宅正人，吉川智啓．“リバーストランスフェクション”，「遺伝子医学MOOK(ムック)」5号株式会社メディカル ドゥ (2006).

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技術応用に関する論文

1. Yamada, S., Hakamada, K., Munakata, T., Takano, K., Fujita, S., Miyake, M, Miyake, J. (2009) The system for analyzing the event timing profile of each single-cell by using the model of neurite maturation of PC12D cell. Biosens. Bioelectron., 24, 1493-1497.
2. Onuki-Nagasaki, R., Nagasaki, A., Hakamada, K., Uyeda, Q., P., T., Fujita, S., Miyake, M., Miyake, J. (2008) On-chip screening method for cell-migration genes based on a transfection microarray. Lab Chip, 8, 1502-1506.
3. Yamada, S., Nomura, T., Takano, K., Fujita, S., Miyake, M, Miyake, J. (2008) Expression of a chimeric CSF1R-LTK mediates ligand-dependent neurite outgrowth. Neuroreport., 19, 1733-1738.
4. Onuki-Nagasaki, R., Nagasaki, A., Hakamada, K., Uyeda, Q., P., T., Fujita, S., Miyake, M., Miyake, J. (2010) Transfection Microarrays for High-Throuput Phenotypic Screening of Genes Involved in Cell Migration. Method in Mol Biol, 193-203.
5. Identification of twinfilin-2 as a factor involved in neurite outgrowth by RNAi-based screen. Yamada, S., Uchimura, E., Ueda, T., Nomura, T., Fujita, S., Matsumoto, K., Funeriu, D. P., Miyake, M*, Miyake, J. Biochem. Biophys. Res. Commun., 363, 926-930 (2007).
6. Retinoic acid induces functional c-Ret tyrosine kinase in human neuroblastoma. Yamada, S., Nomura, T., Uebersax, L., Matsumoto, K., Fujita, S., Miyake, M.*, Miyake, J. NeuroReport, 18, 359-363 (2007).
7. Advances in Transfection Microarray-based studies of neuronal cell lines , Eiichiro Uchimura, Shigeru Yamada, Kayo Matsumoto, Michiko Kishi, Tomohiro Yoshikawa, Daniel P. Funeriu, Masato Miyake, Jun Miyake, Cytometry Research.14, 39-44 (2004).
8. 吉川智啓、三宅正人、藤田芳司　「創薬ターゲットとしてのプロテインキナーゼの網羅的解析」、実験医学増刊号　Vol126、羊土社、2008
9. 佐藤孝明、三宅正人　「細胞・組織を用いたセンシング」、バイオセンサ・ケミカルセンサ事典、テクノシステム、2007

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技術とその応用に関する総説

1. Fujita, S., Takano, K., Ota, E., Yoshikawa, T., Sasaki, C., Sano, T., Miyake, M., Miyake, J. (2010) New Methods for Reverse Transfection with siRNA from a Solid Surface. Method in Mol Biol., Min, W-P. eds. Humana Press, 197-209.
2. Miyake, M, Yoshikawa, T., Fujita, S. Miyake J.(2009) Transfection microarray for drug discovery, Molecular Biology, 5, 444-449
3. Wheeler, DB., Carpenter AE., Sabatini DM. (2005) Cell microarrays and RNA interference chip away at gene function. Nature Genetics, 37, 525-530.
4. 三宅正人，“創薬を変えるトランスフェクションアレイ技術”，「Bioベンチャー2004年7・8月号」，　羊土社（2004.7）
5. 三宅正人，“ゲノムチップ”，「化学フロンティア13　ナノバイオエンジニアリング」，杉本直己編著，化学同人（2004.3）
6. 三宅正人，吉川智啓，内村英一郎．「トランスフェクションアレイ技術とその応用」放医研シンポジウム報文集「テーラーメード放射線治療を目指して」，実業公報社pp.169-174.

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FAQ

お手持ちの細胞のsiRNAトランスフェクション条件を簡便に決めるために最適の製品です。

その条件に従って、ご希望のsiRNAトランスフェクション実験用プレートをカスタム製造いたします。

お客様のご希望のカスタムプレートの作製をお受けいたします。費用は、用いる核酸やご希望のレプリカ数によって大きく違いますので別途お見積いたします。

以下の核酸をご提供ください。
1）性状：凍結乾燥でも溶解液(5μM以上を推奨)でも可
2）形状：プラスチックチューブでもプレート分注でも可 。後者の場合、レイアウトは別途ご相談させていただきます。
3）収量：0.1nmol以上が望ましい。ただし、レプリカ数により変動しますので、別途確認させていただきます。 ただし、対照群については、ライブラリーよりも多くの収量を必要とします。

他社のトランスフェクション試薬では、最適な条件を見つけるための試行錯誤が必要ですが、本製品を使えば煩雑な試薬調製を行うことなし、簡便にsiRNAトランスフェクション条件を決めることができます。本製品は、初代培養細胞、間葉系幹細胞、神経系の細胞など、siRNAトランスフェクションが困難な細胞にもお試しいただける固相トランスフェクション法によるready-to-useの条件検討用プレートで、当社が長年の製薬企業様や大学様との共同研究での経験から厳選した、140以上の条件が1枚のプレート（384ウェル、1536ウェルの場合、96ウェルの場合は4枚のプレート）に載っており、各社の試薬をお試しいただく必要がありません。

ご購入後は－20℃で保存して下さい。細胞を準備いただいた時点で、室温でパックを開封していただき、細胞を播種していただきます。インキュベーション後、プレートリーダーで読み取っていただき、そのデータを付属のスプレッドシートにコピー＆ペーストしていただきます。スプレッドシート上で、閾値を設定していただき、1～数条件に絞り込むことができます。複数の細胞において共通に有効なトランスフェクション条件を見出す際には、最低各細胞に対して1枚の384プレートを使用いただき、そのデータの共通性から導入条件の決定をしていただけます。
なお、細胞の播種密度や、測定タイミングは、細胞によって変動いたしますので、御使用の細胞の増殖速度など応じて設定ください。測定タイミングの目安は、顕微鏡観察を行い、ポジティブコントロール導入細胞の死滅状況を確認し、設定ください。なお、フェノタイプ変化（細胞死）を、siRNAトランスフェクションの指標とするため、mRNAノックダウン効率の上昇とフェノタイプ変化の間には、タイムラグ（およそ、24-48時間程度の遅れ）が生じます。

お手持ちの細胞（ウィルス・マイコプラズマ感染がないことが確認されていることが必要です）をお預かりして、本製品を用いた条件検討を受託するサービスも別料金で承っておりますので、お問い合わせください。

siRNAトランスフェクションの成否を知るためのsiRNA、カチオン性脂質・ポリマーから成るトランスフェクション試薬、当社独自の促進剤、の3つの成分が、様々な混合比（140通り以上の組み合わせ）で各ウェルにプリントされています。

本製品は、siRNA、トランスフェクション試薬、促進剤の3つの成分比がノウハウになっており公開できません。但し、トランスフェクション試薬の種類については、お客様のご要望に従い、お知らせいたします。

本製品は、siRNA導入により引き起こされる細胞死を指標に最適条件を探索します。なお、決定された条件に従って作成したプレートは、siRNAトランスフェクション実験で行う通常のアッセイ（細胞死、抗体染色、化学発光・蛍光・発色法など）が可能です。

本製品では、予めレポーター遺伝子を導入した細胞を播種していただくことを想定しております。

市販のドロッパー、または、ピペットで播種してください。後者をご利用の場合は96ウェルもご用意できますので、96ウェルをご希望の場合は代理店へお問い合わせください。また、プレート遠心機を併用いただくことで、操作性、データの再現性などにポジティブな影響を得られます。

同じです。ただ、リバーストランスフェクション時には、トランスフェクションミックスボリューム＋細胞懸濁液量＝培養容量となりますが、本製品では、ミックスボリュームのデッドボリュームを考量しなくてもよいため、培養容量の細胞懸濁液を分注ください。このため、播種密度は、底面積当たりの播種量を基準とし、細胞懸濁液を調製いただく必要がございます。

細胞種や実験条件（アッセイ条件）によって異なりますが、96ウェルを基準とした際の培地の量の比較の目安をご参考までにお示しします。384ウェルを用いるとトランスフェクション時のみでなく、アッセイに用いる試薬の量も節約できます。また、スクリーニングには、より高密度な1536ウェルもご用意しております。

ウェル当り	96ウェル	384ウェル	1536ウェル
培地の量	100 μℓ	20－40μℓ	2－5μℓ

接着系の各種細胞に適しており、ほとんどの接着系細胞でsiRNAトランスフェクション実験が可能です。また、浮遊系細胞においても、プレートを遠心して細胞を固相表面に濃縮することにより、同様の効果が得られるケースを確認しております（浮遊系細胞についてはご購入前にお問い合わせください）。

当社の促進剤は、細胞への取り込みのみを促進するため、遺伝子導入後の効果については、従来法と同じと考えられます。

エンドサイトーシス・ファゴサイトーシス、マクロピノサイトーシスといった細胞の生理的な食作用・飲作用によるものと考えられております。本製品に含まれる当社の促進剤は、食作用・飲作用を促進するものと推察しております。また、増殖能のない細胞系での実績もありますことから、増殖非連動系への利用も可能です。

フィブロネクチンなどECM（細胞外マトリクス）を用いた系では一部、分化誘導を惹き起こすことが知られていますが、本製品の促進剤はECMではなく、哺乳動物細胞には存在しないペプチド蛋白を用いており、現在のところ、促進剤が動物細胞においてアーティファクトとなるようなシグナリング等は確認されておりません。

毒性は細胞で異なりますが、本製品では、細胞毒性も含め最適条件を探索いたします。本製品中に、固相化を行っていないウェルを設置しておりますため、このウェルと、陰性対照導入ウェルとの差を評価いただくことで、トランスフェクションの細胞障害性を評価することが可能です。これまでの経験では、細胞毒性は従来法と同等または、それよりも低くなるようです。

siRNAトランスフェクション効率については、プレート間、プレート内で十分な再現性が確認されております。例えば、あるライブラリーを384プレートに固相化し、このコピーを用い、別々の日にHeLa細胞を播種、細胞内ATP測定を行った結果、データのピアソン積率相関係数は、0.9以上となり、きわめて高い再現性を示しました。

140以上の条件の陰性対照を含むトータル約300条件を1セットとしているため、384ウェル1枚には1セットを搭載(n=1)、1536ウェルでは4セットを搭載(n=4)しておりますが、プレート間の再現性も確認しておりますので、384ウェル2枚以上を用いたn=2以上の実験や、1536ウェルでのn=8以上の実験も可能です。なお、カスタムでのプレート作製に当たっては、本製品での最適条件決定後、上位数条件を基準に、お客様のご希望の核酸に応じて、再度、条件検討をいたします。その際にはn=4～6以上の実験を行い再現性を確認します。

本製品は、固相トランスフェクション法による効果をベースにしております。そのため、本製品で決定された条件をそのまま従来の液相系で用いることは出来ません。

固相トランスフェクションは、少量の細胞で多数の実験を行う際に有効です。ご希望の実験規模や使用する核酸によっても大きく異なりますので、実験条件によっては、コスト高となってしまうケースもございます。本製品をお試しの際に、お問い合わせください。

本製品をそのまま使用することはできません。

上記以外の哺乳動物細胞やその他の生物の細胞についてはお問い合わせください。

未開封状態で、－20℃で12ヶ月の保管が可能です。室温での保管はおやめください。

特に制約条件はございません。培地に含まれる血清濃度や添加因子の影響を受ける場合もございますため、特殊な培地、培養条件をお試しの場合は、購入前にお問い合わせください。

本製品には各siRNAトランスフェクション条件に、陽性対照、陰性対照を設定しております。陽性対照は、導入されることで細胞死を誘導するため、siRNAトランスフェクションがなされた条件では、細胞死が観察、測定されます。これを、MTT法や細胞内ATPなどの測定法を用い評価することにより、導入効率の良い条件を見出します。（MTT法：3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) を細胞に加えると、生細胞では MTT が還元されて MTT formazanが生成する。MTT formazan の量を 550 nm の吸光度で測定する方法。）蛍光系や吸光系の測定では、バックグラウンド値が高くなる場合がございますので、その際は、外周ウェルなどを用いて、バックグラウンド補正を行っていただくことで、正当なS/N比を評価することが出来ます。

これまでのところ、本製品でご用意した条件で効果が確認できなかった細胞はありませんが、条件が決まらないことがありましたらお知らせください。

可能です。但し、本製品でsiRNAトランスフェクション条件を決定した後、実際にご使用になるsiRNAの組み合わせにて、再検討を行うことをお勧めいたします。その上で、スクリーニングプレートをカスタムにて対応させていただきます。

本製品では、siRNAを導入するため、トランスフェクションは一過性transientとなります。ノックダウン効果の維持期間につきましては、使用されるsiRNA配列に強く依存いたしますため、一概に申し上げることが出来ません。これまでの経験では、siRNA導入後24-120時間で、mRNAの低下、表現型の変化が観察されております。

いくつかの細胞およびsiRNAにおいて、条件検討プレート内のViabilityの差異があった条件で、特定のmRNAをターゲットとするsiRNA導入を行い、mRNA定量を行った結果、正の相関を確認しております。

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