抗体よもやま話 読者コメント Re: イムノブロットのバンドを質量分析計で同定したい【Re: イムノブロットのバンドを質量分析計で同定したい - ご感想・意見交換 - 読者コメント】 - バイオマーケットjp

Re: イムノブロットのバンドを質量分析計で同定したい

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対象コンテンツ 抗体よもやま話
元記事 イムノブロットのバンドを質量分析計で同定したい
要旨  標的とする抗原が未同定のモノクローナル抗体をもっている研究者から以下のような相談がありました。「がん細胞に高発現している抗原に対するモノクローナル抗体をもっています。...

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前の投稿 - 次の投稿 | 親投稿 - 子投稿.1 .2 .3 | 投稿日時 2015/10/6 10:48
sandiegan  シニア   投稿数: 15
共沈させ、酸性下で抗原と解離。
分子ふるいで100K以下くらいにして質量分析。
なんて方法ではだめですか?
イイね!:1
前の投稿 - 次の投稿 | 親投稿 - 子投稿なし | 投稿日時 2015/10/6 10:50
sandiegan  シニア   投稿数: 15
酸性でなくても、塩濃度とかで解離させることが可能であればそのほうが容易かもしれません。
イイね!:0
前の投稿 - 次の投稿 | 親投稿 - 子投稿なし | 投稿日時 2015/10/15 7:19
vk0264  ビギナー   投稿数: 1
まずはその抗体で免沈でしょうか。
60kそのものと60kに結合していたものと夾雑物とが、どのような程度で認められるかで次を考えます。
イイね!:1
前の投稿 - 次の投稿 | 親投稿 - 子投稿.1 | 投稿日時 2015/10/15 21:52
nikuniku  ビギナー   投稿数: 1
免沈できる抗体であればそれが一番ですが、二次元電気泳動で展開すればスポットから質量分析にいけるかもしれません。
イイね!:1
前の投稿 - 次の投稿 | 親投稿 - 子投稿なし | 投稿日時 2015/10/16 14:25
ohmiS  シニア   投稿数: 15
このモノクローナル抗体で免疫沈降がうまくかどうかは大事なポイントですね。これと関連しますがもうひとつ、抗原がどのようなたんぱく質かを知ることも重要です。がん細胞の表面抗原に対する抗体ならば、抗原は膜たんぱく質の可能性が高いです。膜たんぱく質を抽出して分散させてから免疫沈降の実験をすることになります。抗原が細胞内可溶性たんぱく質ならば、がん細胞を破砕して遠心操作の上清を用いて免疫沈降をすることになります。
イイね!:1
前の投稿 - 次の投稿 | 親投稿 - 子投稿なし | 投稿日時 2015/10/16 14:26
ohmiS  シニア   投稿数: 15
そうですね。免疫沈降の系が 活用できれば、モノクローナル抗体に結合した画分をもういちど SDS-PAGE とイムノプロットでチェックしてみます。CBB 染色(たんぱく質染色)と抗体染色のバンドが一致していればゲル内消化/質量分析をやってみるというのもよいかもしれません。
イイね!:1
前の投稿 - 次の投稿 | 親投稿 - 子投稿なし | 投稿日時 2015/10/16 14:27
ohmiS  シニア   投稿数: 15
SDS-PAGE の代わりに二次元電気泳動(等電点電気泳動+SDS-PAGE)というのもやってみる価値はありますね。二次元電気泳動/イムノブロットの染色スポットが CBB染色と一致してくれればしめたものです。
イイね!:1


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