抗体書籍の著者による抗体基礎知識 「イムノブロットのバンドを質量分析計で同定したい」 - 抗体よもやま話

イムノブロットのバンドを質量分析計で同定したい


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  著者:  作成:2015/9/24 0:03:43

大海 忍

 標的とする抗原が未同定のモノクローナル抗体をもっている研究者から以下のような相談がありました。
「がん細胞に高発現している抗原に対するモノクローナル抗体をもっています。がん細胞の全たんぱく質を SDS-PAGE で分離しイムノブロットをおこなうと分子量が60K あたりのバンドが染まります。抗体が結合するバンドを質量分析計などを利用して同定したいと考えています。具体的にどのような実験をすれば良いか教えて下さい。なお、SDS-PAGE のゲルをクマシーブリリアントブルー染色すると60K あたりの移動度には幾つものバンドが見えて、どのバンドが抗体で染まっているかは判断が難しいです。また、正常細胞をイムノブロットしたときは、同じ60K の位置にうっすらと染まるバンドがあります」
 いかがでしょうか。細胞の全たんぱく質ですから SDS-PAGE だけで分離することは難しいですよね。SDS-PAGE の前に何か処理をするとか、あるいは SDS-PAGE の60K 付近をさらに分画するとか、なんでも結構です。アイデアを書き込んでいただくと幸いです。関連した実験操作に関する質問も歓迎します。

 

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ohmiS  投稿日時 2015/10/16 14:27

SDS-PAGE の代わりに二次元電気泳動(等電点電気泳動+SDS-PAGE)というのもやってみる価値はありますね。二次元電気泳動/イムノブロットの染色スポットが CBB染色と一致してくれればしめたものです。

ohmiS  投稿日時 2015/10/16 14:26

そうですね。免疫沈降の系が 活用できれば、モノクローナル抗体に結合した画分をもういちど SDS-PAGE とイムノプロットでチェックしてみます。CBB 染色(たんぱく質染色)と抗体染色のバンドが一致していればゲル内消化/質量分析をやってみるというのもよいかもしれません。

ohmiS  投稿日時 2015/10/16 14:25

このモノクローナル抗体で免疫沈降がうまくかどうかは大事なポイントですね。これと関連しますがもうひとつ、抗原がどのようなたんぱく質かを知ることも重要です。がん細胞の表面抗原に対する抗体ならば、抗原は膜たんぱく質の可能性が高いです。膜たんぱく質を抽出して分散させてから免疫沈降の実験をすることになります。抗原が細胞内可溶性たんぱく質ならば、がん細胞を破砕して遠心操作の上清を用いて免疫沈降をすることになります。

nikuniku  投稿日時 2015/10/15 21:52

免沈できる抗体であればそれが一番ですが、二次元電気泳動で展開すればスポットから質量分析にいけるかもしれません。

vk0264  投稿日時 2015/10/15 7:19

まずはその抗体で免沈でしょうか。
60kそのものと60kに結合していたものと夾雑物とが、どのような程度で認められるかで次を考えます。

sandiegan  投稿日時 2015/10/6 10:50

酸性でなくても、塩濃度とかで解離させることが可能であればそのほうが容易かもしれません。

sandiegan  投稿日時 2015/10/6 10:48

共沈させ、酸性下で抗原と解離。
分子ふるいで100K以下くらいにして質量分析。
なんて方法ではだめですか?



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